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    Rivelazione e caratterizzazione di inquinanti tossici in acqua di mare ed animali marini

    PROGETTI RETROSPETTIVI COERENTI CON LA MISURA 3.5 DEL FEP CAMPANIA 2007 – 2013 (ex D.D. del 21.12.2015, n° 854)

     Responsabile Scientifico: Giovanna Romano


    Descrizione Progetto

    Il progetto Rivelazione e caratterizzazione di inquinanti tossici in acqua di mare ed animali marini ha affrontato tematiche relative all’inquinamento ambientale con particolare riguardo all’inquinamento delle acque costiere marine da metalli pesanti ed idrocarburi policiclici aromatici, per l’impatto enorme che la presenza di queste sostanze tossiche può avere sulla salute dell’uomo, sia mediante contatto diretto sia attraverso il consumo di pesce e molluschi per uso alimentare.

    Il progetto è stato finanziato nell'ambito della MISURA 3.5 DEL FEP CAMPANIA 2007 – 2013, (ex D.D. del 21.12.2015, n° 854).

    Gli Istituti partner del progetto hanno svolto attività di ricerca focalizzate sulla messa a punto di metodi biochimici, biofisici e biologici per la determinazione sia del mercurio che di alcuni IPA, in acqua di mare o in matrici che ne mimano la composizione.

    Le azioni previste dal Progetto hanno mirato in particolare alla caratterizzazione delle proprietà tossicologiche del mercurio in ricci di mare e copepodi nonché alla raccolta di dati analitici di concentrazione di mercurio e derivati di mercurio in molluschi cefalopodi per la caratterizzazione dei livelli di bio-accumulo di metalli in traccia e di sostanze derivate dall’attività umana allo scopo di individuare le eventuali possibili ricadute sul benessere animale e non da ultimo sulla “biosicurezza”.

    Il nostro ruolo:

    Attività svolte dal Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale (SUN- DBBPG) della Seconda Università degli studi di Napoli.

    Molte reazioni biologiche sono determinate a seguito di trattamenti con estratti di frutti e piante, cresciute a ridosso di bacini idrici contaminati. Alcune piante e frutti, o parte di essi, possono essere impiegati per usi terapeutici, spesso sfruttando i principi attivi in essi contenuti. Per questo motivo, dai prodotti naturali possono derivare droghe differenti, caratterizzate da principi attivi qualitativi e quantitativi in grado di sviluppare diverse proprietà terapeutiche. Alcune sostanze estratte da un determinato frutto o da una determinata pianta, possono presentare più di un principio attivo con attività farmacologica in grado di fungere da eccipienti naturali modulando la farmacocinetica del prodotto stesso. Le caratteristiche delle piante o dei frutti utilizzati a scopo terapeutico, nonché la variabilità nel contenuto dei principi attivi, sono alterate anche in base ai fattori ecologici, quali il clima, la costituzione del terreno e i fattori biotici. Negli ultimi anni le sostanze naturali rappresentano dei mediatori ecologici e un potenziale serbatoio di sostanze terapeutiche innovative per la salute umana. Queste molecole sono caratterizzate da un’elevata varietà strutturale e possono essere considerate come punti di partenza per sviluppare librerie di composti selezionate e validate biologicamente.

    L’obiettivo del soggetto attuatore Seconda Università degli studi di Napoli (Dipartimento di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale), è consistito nell’estrapolazione e nella caratterizzazione dei principi attivi contenuti nei prodotti naturali analizzati e nello screening di interazione nei confronti di numerosi targets biologici. Tale obiettivo è finalizzato a studi terapeutici e preventivi legati a gravi patologie quali il cancro, mediante applicazioni mirate su molecole biologiche naturali. Gli scopi dell’obiettivo sono stati realizzati attraverso la collaborazione combinata con altri componenti attuatori del progetto, ossia la Stazione Zoologica Anton Dohrn di Napoli (SZN) e IBB.

    L’unità DBBPG è stata maggiormente coinvolta nell’obiettivo 4. Inoltre, relativamente all’obiettivo, sono stati effettuati degli studi riguardanti le attività benefiche di piante e frutti o di spugne marine e micro-alghe.

    Il metodo è consistito nell’estrazione selettiva di componenti bioattivi contenuti all’interno di piante e frutti, ma anche di microalghe. Le diverse frazioni contenute nei prodotti naturali analizzati, sono state esaminate e sottoposte a metodi di estrazione acetonica, metanolica e purificazione di componenti bioattivi. Inoltre sono stati valutati e caratterizzati, attraverso saggi qualitativi e quantitativi, biochimici ed enzimatici, gli effetti antiproliferativi, antimicrobici e antiossidanti su linee cellulari tumorali umane. In particolare le attività antiossidanti sono state valutate attraverso due metodi: α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) e Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Contestualmente sono state effettuate analisi di ciclo cellulare, di detezione apoptotica e differenziamento attraverso l’utilizzo di un citofluorimetro a flusso. Inoltre sono state effettuate estrazioni di proteine totali (o delle frazioni) ed estrazioni del DNA e dell’RNA delle linee analizzate al fine di individuare specifici targets biologici con impatto di natura epigenetica attraverso tecniche di real-time PCR e PCR semiquantitativa. La morfologia delle cellule trattate, è stata valutata attraverso metodi colorimetrici come il May-Gr¨unwald Giemsa, che, per esempio, permette di differenziare i globuli bianchi in linee tumorali ematologiche. Altre indagini hanno riguardato il livello di proliferazione delle cellule tumorali a seguito del trattamento con composti naturali selezionati. Le attività anticancro dei composti analizzati, sono state anche valutate attraverso esperimenti in vivo ( modelli xenograft) ed ex vivo (blasti primari).

    Per piante e frutti abbiamo studiato Feijoa Sellowiana, originaria dell’America Meridionale, ma viene coltivato anche nell’Italia Meridionale (1). Feijoa presenta tantissime attività benefiche, come l’elevato contenuto di vitamina C, beta carotene, vitamina B6, sali minerali e flavonoidi, che hanno un ruolo importantissimo nel miglioramento dell’apparato circolatorio. La polpa di Feijoa, presenta attività anticancerogene grazie alla quercetina e al canferolo contenuti in essa. In particolare l’estratto acetonico di Feijoa presenta attività antineoplastiche sia in tumori solidi che ematologici. Gli effetti di questo frutto sono mirati prevalentemente verso le cellule tumorali e non ci sono effetti tossici in cellule normali, suggerendo un’attività tumore-selettiva. A seguito di una purificazione dell’estratto acetonico di Feijoa, il flavone è stato identificato come componente attivo. Infatti il flavone è in grado di indurre apoptosi, accompagnata dall’attivazione delle caspasi in cellule umane provenienti da leucemia mieloide acuta. Tali studi sono stati effettuati su campioni di pazienti affetti da leucemia mieloide acuta confermando che l’estratto acetonico derivante da Feijoa e il suo derivato, il flavone, sono capaci di indurre la morte delle cellule cancerose. In Figura 9 è mostrato l’effetto antiproliferativo dell’estratto acetonico di Feijoa in diverse linee tumorali umane, quali il cancro alla mammella (MCF7, MDA-MB 231, SKBR3) e alla cervice uterina (Hela). Tale effetto è stato valutato mediante un saggio quantitativo che utilizza un colorante cellulare chiamato cristal violet. La linea ematologica di leucemia promielocitica (NB4), invece è stata analizzata con attraverso un metodo di colorazione vitale che

    utilizza il tripan blu. Inoltre sono stati valutati anche i livelli di espressione di fondamentali effettori molecolari, tra cui p16, p21 e TRAIL, che sono coinvolti nella regolazione dell’apoptosi tumore-selettiva. I nostri studi hanno coinvolto anche l’utilizzo di piante medicinali come Genista sessilifolia DC (2). Genista è un genere di pianta appartenente alla famiglia delle leguminose e consiste di 87 specie distribuite in

    maniera predominante nell’area Mediterranea. Questa pianta presenta delle foglie sessili o sub-sessili e fiori gialli. In Italia, queste specie si diffondono nei boschi che si trovano a 800 metri al di sopra del livello del mare. La composizione di queste piante è caratterizzata dalla presenza di flavoni, alcaloidi chinolizidinici, glicoflavoni e soprattutto di isoflavoni. In Figura 10 sono mostrati i componenti attivi delle frazioni estrapolate da Genista. Diverse specie di Genista presentano delle attività biologiche interessanti quali funzioni ipoglicemiche, anti infiammatorie, antiossidanti e citotossiche. Tali proprietà sono state esaminate in numerose linee cellulari tumorali umane. Inoltre sono stati valutati gli effetti degli estratti metanolici dalle parti aeree di G. sessilifolia e G. tinctoria. Le parti aeree sono state raccolte durante uno stadio di piena fioritura da piante cresciute nel parco nazionale del Cilento (Salerno). Le attività antitumorali di Genista sono state valutate su cellule di leucemia promielocitica umana NB4. Gli estratti totali di questa pianta hanno mostrato avere effetti antiproliferativi già dopo 24 ore dal trattamento. Inoltre sono stati analizzati gli effetti sul ciclo cellulare e il differenziamento di questi tumori ematologici a seguito del trattamento con l’estratto totale di questa pianta. Gli esperimenti sono stati anche condotti sulla linea di leucemia mieloide acuta umana U937, su cellule di cancro alla mammella come le MDA- MB231 e MCF7, ma anche su cellule di cancro alla cervice (Hela) e cancro alla prostata (LNCAP). La morte cellulare è stata valutata attraverso l’attivazione delle caspasi accompagnate dall’espressione di p21, Rb, p53, Bad e TRAIL, importanti markers noti. Sono state inoltre valutate le caratteristiche delle frazioni della pianta che risultassero essere biologicamente più attive e ne sono state selezionate alcune per una valutazione più dettagliata delle proprietà curative di Genista. Lo studio dell’attività antitumorale da parte di prodotti di origine naturale, si è focalizzato

    anche sulla psammaplina A, isolata per la prima volta nel 1987 da una spugna marina. La psammaplina A è un dimero di disolfuro simmetrico derivato dalla condensazione di unità modificate di tirosina e cisteina (3) e presenta attività antitumorali ed antibatteriche. Il meccanismo d’azione della psammaplina A determina una citotossicità significativa e specifica verso cellule umane di cancro al polmone, ovario, pelle e colon. La psammaplina A è in grado di inibire enzimi epigenetici quali le istone deacetilasi (HDACs) e le DNA metiltrasferasi (DNMTs), che costituiscono dei targets fondamentali per il trattamento e la prevenzione del cancro ed altre patologie. Le modifiche che avvengono nella cromatina rappresentano un altro potenziale meccanismo legato alle attività anticancro svolte dalla psammaplina A. La capacità di avere come bersaglio più di un membro coinvolto nel macchinario epigenetico, ha portato alla sintesi di analoghi di psammapline (4), in modo tale da poter studiare e determinare gli elementi strutturali per il loro profilo epigenetico. Gli effetti della psammaplina A sono stati anche analizzati sulla linea di leucemia mieloide acuta umana U937. In questo modello cellulare sono stati valutati i livelli di apoptosi, ciclo e differenziamento cellulari e l’espressione di importanti markers epigenetici quali p21WAF1 e l’acetilazione della tubulina e dell’istone H3. L’idea di produrre derivati sintetici della psammaplina A ha consentito la possibilità di sviluppare composti capaci di esibire potenzialità antitumorali/antisettiche comparabili o addirittura più efficaci rispetto al prodotto naturale. Tra questi, il composto UVI5008, ha una tripla attività inibitoria concernente gli HDACs, le DNMTs e le sirtuine (5). UVI 5008 è in grado di indurre una significativa metilazione dei promotori RARb e p16 ed è in grado di indurre una selettiva morte di cellule cancerose esercitando le sue attività in diversi modelli tumorali di topo e di cancro alla mammella umani. Le sue capacità antitumorali coinvolgono l’attivazione indipendente di recettori di morte e di specie reattive dell’ossigeno. L’azione di questa molecola è stata valutata su diverse linee di cellule tumorali come le U937, Ku-812F, K562 (derivanti dalla leucemia), le MCF7 ( derivanti dal cancro alla mammella), U2OS (derivanti dall’osteosarcoma), DU145 (derivanti dalla prostata) e HCT116 (derivanti dal colon). E’ stato valutato inoltre, che UVI5008 induce un aumento dei livelli di espressione della proteina p16 nella linea leucemica U937 e saggi in vitro, hanno mostrato che questa molecola agisce come diretto inibitore di DNMT3a ed è in grado di bloccare l’attività di HDAC1-4, noti markers epigenetici. Se trattato nelle U937, UVI5008 è in grado di indurre l’espressione del noto target p21 e l’iperacetilazione dell’istone H3 in blasti leucemici ex vivo. Analisi di immunoistochimica hanno dimostrato una forte espressione dei livelli di acetilazione dell’istone H3 sulla lisina 9 in topi HCT116 xenografts trattati con UVI5008. In Figura 11 è illustrata una rappresentazione schematica dello studio tra la struttura chimica e/o 3D di questi composti e la loro attività biologica: studio SAR (Structure-Activity Relationship). Altre indagini sono state anche condotte su Solanum tuberosum L. var. Vitelotte, che è una varietà di patata ampiamente usata per l’alimentazione e che viene coltivata in Francia sin dal diciannovesimo secolo (6). Questa patata ha un particolare colore viola, determinato da un’elevata presenza di antocianine. Lo studio condotto è stato mirato alla caratterizzazione e alla misurazione della concentrazione di antocianine nelle patate pigmentate per valutare le attività antiossidanti e antimicrobiche e gli effetti antiproliferativi in linee cellulari di cancro sia solido che ematologico. Nella tabella 2 sono illustrati i valori di concentrazione minima inibitoria (MIC) e di concentrazione minima battericida (MIB) provenienti da estratti antocianinici di Solanum tuberosum. In particolare, è stato analizzato un effetto antimicrobico molto forte nel batterio Gram-positivo Staphylococcus aureus e nel fungo Rhyzoctonia solani. Inoltre, ci siamo anche occupati della valutazione in microalghe in forte collaborazione col soggetto capofila (SZN) e con IBB. Su circa 40 specie di microalghe abbiamo eseguito la preparazione di estratti e la valutazione di attività anti-proliferativa/citotossica in vitro su varie linee cellulari tumorali come la linea cellulare U-937 (in

    sospensione) e su linee cellulari derivate da tumori solidi. Verifica contestuale di assenza di citotossicità su linee cellulari primarie/normali. Gli estratti che hanno mostrato un’attività medicinale interessante sono stati frazionati (IBP) ed il materiale è stato ritestato per consentire l’identificazione dei principi attivi.

    Pubblicazioni

    1. Bontempo P, et al. Feijoa sellowiana derived natural Flavone exerts anti-cancer action displaying HDAC inhibitory activities. Int J Biochem Cell Biol. 2007;39(10):1902-14. Epub 2007 May 25. PubMed PMID: 17604209.
    2. Bontempo P, et al. Genista sessilifolia DC. extracts induce apoptosis across a range of cancer cell lines. Cell Prolif. 2013;46(2):183-92. doi: 10.1111/cpr.12022. PubMed PMID: 23510473
    3. García J, et al. Epigenetic profiling of the antitumor natural product psammaplin A and its analogues. Bioorg Med Chem.19(12):3637-49. doi: 10.1016/j.bmc.2010.12.026. PubMed PMID: 21215647)
    4. Pereira R, Benedetti R, et al. Indole-derived psammaplin A analogues as epigenetic modulators with multiple inhibitory activities. J Med Chem. 2012;55(22):9467-91. doi: 10.1021/jm300618u.. PubMed PMID: 23030799
    5. Nebbioso A, et al. Death receptor pathway activation and increase of ROS production by the triple epigenetic inhibitor UVI5008. Mol Cancer Ther.10(12):2394-404. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-11-0525. PubMed PMID: 21980132
    6. Bontempo P, et al. Antioxidant, antimicrobial and anti-proliferative activities of Solanum tuberosum L. var. Vitelotte. Food Chem Toxicol. 2013 May;55:304-12. Doi: 10.1016/j.fct.2012.12.048. PubMed PMID: 23313609

     

     

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